黄曲霉毒素总量免疫亲和柱操作说明书

【概要】

黄曲霉毒素（Aflatoxin）是黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级代谢产物，被世界卫生组织的癌症研究机构划分为1类致癌物，同时又是一种毒性极强的剧毒物质，广泛存在于各种食物中。玉米，花生，大米，小麦等谷物及其副产品是黄曲霉毒素的主要来源，同时饲料中的黄曲霉毒素B1经过动物代谢后产生的黄曲霉毒素M1仍然具有很强的毒性和致癌性，也广泛存在牛奶，血液，组织等食品中。黄曲霉毒素作为肝癌的三大诱因之一，也是诱发胃癌，肠癌等疾病的主要原因之一，对人类的健康构成很大威胁。世界各国对食品，饲料中的黄曲霉毒素都有严格的限量标准。

 

【适用范围及性能】

用于定性、定量检测谷物、副食品、酒类等食品和饲料等样本中的黄曲霉毒素总量（B1,B2,G1,G2）时的样品前处理。

柱容量：≥200ng

回收率：≥85%

 

【试验原理】

本产品的测定的基础是抗原抗体反应，黄曲霉毒素单克隆抗体连接在柱内凝胶上，样品中的黄曲霉毒素经过提取、过滤、稀释，然后将样品提取液缓慢的通过黄曲霉毒素免疫亲和层析柱，在免疫亲和柱内，毒素与抗体结合，之后洗涤免疫亲和柱除去没有被结合的其他物质。用甲醇洗脱黄曲霉毒素，然后注入到分析仪器中用于检测。

 

【包装组成】

根据不同规格，每一个盒中包含5-25支黄曲霉毒素免疫亲和层析柱及1份说明书。

 

【需要而未提供的设备及试剂】

设备：

┅┅高速均质器或组织匀浆机

┅┅粉碎机

┅┅200ml/50ml量筒

┅┅天平：感量0.1g

┅┅微量移液器：单道 100l～1000l

┅┅槽纹滤纸（折叠快速定性或定量滤纸）

┅┅玻璃微纤维滤纸（1.5m孔径）

┅┅50ml漏斗

┅┅一次性玻璃试管

┅┅泵流操作架（包括空气泵，不同容积的玻璃注射器等）

试剂：

┅┅甲醇（色谱级）

┅┅蒸馏水或去离子水

┅┅pH7.0磷酸盐缓冲溶液（PBS）：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL

┅┅吐温-20/PBS溶液（0.1%）：取1mL吐温-20，加入PBS缓冲溶液并定容至1000mL

 

【试剂配制】

样品提取液：根据不同的样品配置不同浓度的甲醇水溶液，作为样品提取液。

 

【样本处理步骤】

（一）花生，玉米，大米，小麦及其制品，植物油脂和饲料

┅┅取25g粉碎的样品（植物油脂直接取样，无需处理）与125mL甲醇-水（7：3）溶液混合；

┅┅加入5.0g氯化钠以均质器高速搅拌，提取2分钟；

┅┅4000r/min离心5min或用槽纹滤纸过滤；

┅┅取15mL滤液并加入30mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤

┅┅取稀释后液体待测；

┅┅将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL样品提取液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体；

┅┅准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

 

（二）酱油

┅┅取50g试样与100mL甲醇-水（8：2）溶液混合；

┅┅加入2.5g氯化钠以均质器高速搅拌，提取1分钟；

┅┅4000r/min离心5min或用槽纹滤纸过滤；

┅┅取10mL滤液并加入40mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤

┅┅取稀释后液体待测；

┅┅将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅用10.0mL 0.1%的吐温/PBS清洗，再以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体；

┅┅准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

 

（三）食醋

┅┅取5g试样，加入1.0g氯化钠；

┅┅以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释定容至25.0mL；

┅┅4000r/min离心5min或用槽纹滤纸过滤；

┅┅取10mL滤液并加入10mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤

┅┅取稀释后液体待测。

┅┅将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL样品提取液注入玻璃注射器；

┅┅将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；

┅┅用10.0mL 0.1%的吐温/PBS清洗，再以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体；

┅┅准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

 

【结果判定】

经免疫亲和柱净化后，收集到的甲醇洗脱液可直接使用荧光计或者HPLC检测，也可使用薄层色谱或者酶联免疫试剂盒进行检测。收集到的1mL洗脱液中的黄曲霉毒素含量相当于1g样品中黄曲霉毒素含量。

 

【高效液相参考谱图】

 

【注意事项】

┅┅黄曲霉毒素危害极大，应戴手套操作。

┅┅使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液最好用5%浓度的次氯酸钠溶液浸泡过夜。

┅┅不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。

 

【贮藏条件及保存期】

贮藏条件：亲和柱可于常温保存，2-8℃储存可延长有效期，不可冻存

保存期：该产品有效期为12个月。